雌激素受體-α 在調節軟骨細胞表型和機械負荷反應中的新作用

雖然骨關(guan) 節炎（OA）的發病機製是多因素的，但關(guan) 節表麵的機械超負荷是 OA 發病和進展的已知驅動因素。軟骨細胞衰老被認為(wei) 是 OA 軟骨的一個(ge) 重要特征。研究表明，人軟骨細胞在動態壓縮負荷大於(yu) 20% 時，可誘導衰老相關(guan) 標誌物的表達，然而，機械負荷影響軟骨細胞衰老的機製仍有待闡明。

研究報道，與(yu) 健康對照組相比，OA 患者軟骨細胞上的雌激素受體(ti) -α（ERα）水平降低。此外，在 OA 的體(ti) 外模型中，用促炎細胞因子白細胞介素1β（IL-1β）刺激軟骨細胞上調 microRNA 203（miR-203）表達，從(cong) 而拮抗 ERα 功能，導致炎症增加，細胞活性和軟骨生成基質蛋白表達降低。這支持 ERα 在介導軟骨細胞表型中的作用。有趣的是，發現靜水壓力形式的機械負荷可以通過 ERα 調節成骨，這支持通過 ERα 探索軟骨形成表型的機械轉導信號。

鑒於(yu) 此，美國匹茲(zi) 堡大學醫學院骨科及中國中南大學湘雅醫院骨科的研究團隊曾證明了ERα 是 OA 中軟骨細胞表型的重要調節因子，包括調節衰老和降解酶的產(chan) 生。特別是，ERα 缺失的軟骨細胞通過顯著提高與(yu) 肥大和成骨相關(guan) 的分子的表達水平來響應損傷(shang) 性的機械負荷，這是 OA 軟骨中發現的關(guan) 鍵特征。因此，恢複和維持軟骨細胞中的 ERα 功能可能代表了 OA 的未來治療幹預。研究成果發表在Osteoarthritis and Cartilage期刊題為(wei) “Novel role of estrogen receptor-α on regulating chondrocyte phenotype and response to mechanical loading”。

首先，研究人員從(cong) 接受 TKA（全膝關(guan) 節置換術）的患者中收集人類 OA 膝關(guan) 節軟骨組織，所有保存的軟骨均有輕微至輕度的宏觀損傷(shang) ，對照軟骨樣本表麵完整，受損軟骨樣本表現出嚴(yan) 重的退化。

與(yu) 對照軟骨相比，受損軟骨含有較少的糖胺聚糖（GAG），並顯示出更高水平的 MMP13、p16INK4a和 SA-β-gal。為(wei) 了證實組織學結果，從(cong) 保存的（P-CHs）和受損（D-CHs）軟骨中分離出軟骨細胞（CHs），進行 qRT-PCR 和蛋白質印跡檢測，發現 D-CHs 在衰老、炎症、纖維化、成骨和降解相關(guan) 基因方麵的表達水平高於(yu) P-CHs。蛋白質印跡分析進一步證實了 D-CHs 的衰老和骨關(guan) 節炎特征，如較高水平的 p16INK4a、p21 和 MMP13。通過檢測 P-CHs 和 D-CHs 的軟骨形成能力，發現 D-CHs 產(chan) 生的軟骨顆粒通常遺傳(chuan) 了受損軟骨的表型，如低 GAG 沉積和高水平的細胞衰老（圖1 A）。

總的來說，與(yu) 保存的對照軟骨和 P-CHs 衍生組織相比，受損的軟骨和 D-CHs 衍生組織表現出更高水平的衰老、炎症、纖維化、成骨和降解。

由於(yu) p16INK4a在 D-CHs 中顯著上調，因此測試了抑製 p16INK4a是否可以逆轉 D-CHs 中的 OA 表型（圖1 B）。結果表明，在 2D 軟骨細胞培養(yang) 上，sip16INK4a處理顯著降低 p16INK4a水平（圖1 F），並部分逆轉衰老水平（圖1 C、D）。但是，p16INK4a 抑製的 D-CH 顆粒在軟骨生成刺激下無法產(chan) 生軟骨（圖1 E），盡管軟骨生成基因水平沒有顯著受損（圖1 D）。此外，抑製 p16INK4a促進了 MMP13 的表達（圖1 D、F）。這說明，在 D-CHs 中抑製 p16INK4a不會(hui) 增強 D-CHs 在體(ti) 外生成健康軟骨的能力。

圖1 通過siRNA抑製D-CHs中的p16INK4a在逆轉D-CHs的不良表型方麵

接下來，為(wei) 了確定對照和受損組軟骨之間的差異因子，進行了 RNA-Seq 分析以檢查 P-CHs 和 D-CHs 的轉錄組。結果顯示，D-CHs 中軟骨降解相關(guan) 基因的變化最大。有趣的是，雌激素受體(ti) 家族和雌激素受體(ti) -1（ESR1），一種編碼雌激素受體(ti) -α（ERα）的基因，都位列上遊調控因子的前5名。與(yu) P-CHs 相比，D-CHs 的 ESR1 表達顯著降低。ERα 的下遊靶點顯示，許多與(yu) 軟骨功能和 OA 相關(guan) 的基因被預測受ERα調控，包括p16INK4a。通過檢測不同樣本中的 ERα 水平，驗證了ERα 在嚴(yan) 重損傷(shang) 的軟骨中下調。

由於(yu) D-CHs 表現出低 ERα 表達，因此測試了升高 ERα 是否可以逆轉 D-CHs 的 OA 表型。結果表明，增強 ERα 水平不僅(jin) 降低了衰老水平且增加了增殖潛力，同時也改善了 OA 表型。這說明，ERα 可調節軟骨細胞表型。

由於(yu) 軟骨損傷(shang) 最常見於(yu) 體(ti) 內(nei) 機械應力最高的膝關(guan) 節區域，因此實驗還研究了降低的 ERα 水平是否與(yu) 機械負荷有關(guan) ，以及降低的 ERα 水平是否改變了軟骨細胞對機械負荷的反應。實驗過程中使用了0.2Hz，0%、5% 和 20% 的應變，分別代表了靜態、中等負荷和損傷(shang) 性負荷的情況。結果顯示，5% 或 20% 動態壓縮負荷下，軟骨細胞 ESR1 的表達降低（圖2 B、C、F）。此外，20% 負荷會(hui) 導致 siCON 細胞中分解代謝基因（如 ADAMTS4 和 MMP13）的上調，以及衰老標誌物（包括p16INK4a和p53）的增加（圖2 B、D-F）。這說明，ERα 水平受機械負荷的調節。

考慮到 ERα 對軟骨細胞衰老和軟骨形成表型的影響，以及其對機械負荷的反應，實驗還研究了 ERα 在調節壓縮負荷對軟骨細胞表型的影響中的作用。結果顯示，當存在 ESR1 表達時，20% 應變下的機械負荷不再引起先前看到的 p16INK4a和 MMP13 表達的增加。相反，敲低 ESR1 表達時施加機械負荷會(hui) 降低這兩(liang) 種分子的表達（圖2 B、D-F）。值得注意的是，機械負荷和 ESR1 敲低都增加了 P-CHs 中磷酸化的 p65（pho-p65）的水平，這是細胞應激的代表性標誌物。這些數據說明，抑製 ERα 會(hui) 改變軟骨細胞對壓縮負荷的反應性。

圖2 ERα在介導軟骨細胞對機械負荷反應中的作用—檢測分解代謝

最後，實驗進一步研究了機械負荷和 ERα 表達在調節軟骨生成、纖維化和成骨基因中的相互作用。當 ESR1 表達保留（siCON）時，5% 和 20% 應變下的機械負荷對成骨或纖維化標記基因的表達沒有顯著影響，盡管 OSX 和 VCAN 在 20% 壓縮應變下顯著上調（圖3 A）。然而，COL2A1 存在應變反應性的下調（圖3 D）。有趣的是，單獨敲除 ESR1 （0% siESR1）顯著上調了 OCN 的表達，同時抑製了 COL2A1 和軟骨寡聚基質蛋白（COMP） 的水平（圖3 A-D）。雖然 5% 的應變壓縮負荷對 ESR1 敲除沒有緩解作用，但20% 的應變傾(qing) 向於(yu) 進一步上調肥大相關(guan) 標誌物，包括 COL10 和 OCN（圖3 B-D），同時還逆轉了 ESR1 敲除對 COL2A1 和 COMP 水平的抑製作用（圖3 D）。值得注意的是，與(yu) P-CHs 相比，在人類的 D-CHs 中也觀察到 OCN 水平的提高（圖3 E、F），並且與(yu) 野生型對照相比，在從(cong) ESR1 敲除小鼠中分離的軟骨中也觀察到 OCN 水平增強（圖3 E、G）。這說明，ERα 的缺失和壓縮超負荷協同增加軟骨細胞的肥大轉化。

應該注意的是，瞬時受體(ti) 電位陽離子通道亞(ya) 家族v 成員4（TRPV4）的表達是一種公認的機械敏感 Ca2+ 通道，對機械負荷也有反應。在 siCON 組中，5% 的負荷顯著上調了 TRPV4 的表達，然而，較高的壓縮應變（20%）適度降低了 TRPV4 的表達（圖3 D）。此外，ESR1 敲除不會(hui) 改變 TRPV4 蛋白水平，但確實調節了機械負荷的影響，因為(wei) 增加應變幅度會(hui) 誘導 TRPV4 表達可觀察到的劑量依賴性增加（圖3 D）。

基於(yu) 上述研究的結果，ERα 在調節軟骨細胞表型和對機械超負荷反應中的途徑如圖4所示。

圖3 ERα在介導軟骨細胞對壓縮負荷反應中的作用—檢測軟骨形成

圖4 ERα信號通路在調節軟骨細胞表型中的作用。

總之，該研究表明，ERα 在介導軟骨細胞表型及其對機械負荷的反應中具有新的雌激素非依賴性作用，並表明提高 ERα 水平可能代表了一種治療骨關(guan) 節炎的新方法。